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先说个核心判断：如果能同时看清一个细胞里几十种蛋白质的动向，很多生物学问题可能会迎刃而解。但这个看似简单的目标，多年来一直卡在同一个瓶颈上。

传统方法的局限

传统做法是给每个目标蛋白染上不同颜色的荧光。听起来很简单，但实际操作中，荧光颜色就那么多。

要同时看的蛋白越来越多，颜色很快就不够用了。更麻烦的是，不同荧光蛋白之间还会互相干扰。

光谱重叠会让图像变得模糊，复杂生物过程的解析也就无从谈起。

技术瓶颈：天然蛋白的局限性

这些年，研究人员开始尝试设计一种小型蛋白标签，专门去识别特定的荧光染料。但问题在于，天然蛋白很难同时满足“稳定折叠”、“体积小”、“亲和力强”这几个条件。

传统的蛋白工程改造，基本是在天然模板上来回修补。这种方式费时费力不说，天花板也很明显——天然结构本身就限制了优化的空间。

技术突破：NovoTag问世

2026年7月16日，大卫贝克团队在《Science》上发表了一项研究，提出了一个名为NovoTag的技术路线。

简单来说，他们用AI蛋白设计、结构预测和实验筛选组成了一套闭环。团队从零开始设计出能特异性结合不同荧光染料的全新蛋白标签，并在此基础上构建了一套适用于多目标荧光成像的蛋白-染料体系。

论文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.aeb0822

重新设计蛋白：从零开始

过去，荧光标签的研发路径基本都围绕着天然蛋白。研究人员通常会先找一种天然蛋白，它恰好能结合某个小分子。然后通过定点突变、定向进化等办法，一点一点优化结合能力。

这条路确实走出了不少成果，但也暴露了深层的局限。天然蛋白各有各的生物学使命，它们的结构并不是为了识别人工荧光染料而进化出来的。所以再怎么改造，能优化的空间始终有限。

这次，研究团队选择了另一条路。他们借鉴了“伪环状结构”的思路。让蛋白质形成一个封闭的环状口袋，把染料整个包裹进去。这种结构在天然小分子结合蛋白里其实很常见，但过去从未有人系统性地把它用在“配体感知”的设计语境里。

他们的想法很简单直接：与其在天然蛋白上修修补补，不如从一开始就针对目标荧光染料，设计一种全新的蛋白结构。

图 1：结合 Janelia 荧光染料蛋白的设计与表征。

设计流程与筛选

技术上，团队用的是Cα RFdiffusion——一种生成式深度学习模型。他们直接围绕每种染料的三维结构，生成蛋白质骨架。这意味着模型从起点就知道染料的位置和形状，然后在染料周围“生长”出合适的蛋白结构。

接着用LigandMPNN给骨架配上序列，再用Rosetta算结合能，用AlphaFold2验证序列和结构是否一致。几千个候选设计里，只有高置信度的才会被挑出来，最后在酵母表面展示和流式分选中确认活性。

这些Janelia Fluor染料是人工合成的罗丹明衍生物。团队借助机器学习驱动的de novo蛋白设计，从零开始，造出了三种小型结合蛋白：

• NovoTag494：特异性结合绿色染料
• NovoTag596：特异性结合橙色染料
• NovoTag657：特异性结合远红色染料

有意思的是，这三种目标染料共享同一个罗丹明核心骨架，只是在边缘的化学修饰上有细微差别。这种结构相似性，对特异性提出了极高的要求。结合蛋白必须像精密模具一样，识别出染料核心周围每一个取代基的微小差异。

图 2：利用 NovoTags 在活细胞和固定细胞中进行多重超分辨率荧光显微镜成像。

进入应用场景：验证与数据

对于蛋白设计来说，最大的挑战永远在计算预测和生物实验之间。一个在计算模型里看起来完美的结合口袋，很可能因为蛋白折叠不稳定、分子环境变化，或者细胞内部的复杂条件，最终无法实现预期功能。

研究团队先针对多种不同的荧光染料，设计了一批候选蛋白标签。然后通过实验筛选出那些真正能稳定表达、正确折叠并与目标分子结合的结构。

结果发现，部分从头设计的蛋白确实实现了高度特异性的染料识别，同时保持了较小的尺寸和良好的稳定性。

更关键的是，通过改变蛋白结合口袋的结构，不同NovoTag可以分别识别不同的荧光染料。每一种标签都相当于一个独立的“分子接口”，只与对应的染料产生选择性结合，尽量避免和其他染料发生干扰。

图 3：基于荧光寿命的 NovoTags 多重成像显微镜技术。

AlphaFold 3的预测也证实了这一点。三种NovoTag与各自靶标染料形成的复合物，获得了最高的置信度评分。

它们对靶标染料的亲和力达到了纳摩尔级别：

• Kd分别为19.1 nM
• Kd分别为1.5 nM
• Kd分别为2.0 nM

最重要的是，它们对其他两种染料的特异性超过1000倍。这个数据，已经远远超出了传统改造路线能达到的水平。

新一代的标记方式：意义与展望

NovoTag的意义，远不止是提供了一种新的荧光标签。它标志着蛋白质设计正在从“模仿自然”走向“超越自然”。

自然界从来没有进化出能结合这些人工染料的蛋白，但计算工具让我们可以为任何小分子量身定制结合器。

当然，NovoTag还面临不少挑战。比如，如何提高设计成功率，如何扩大可识别染料的范围，如何让这些标签适应更复杂的生物环境。这些都是接下来需要解决的问题。

据研究团队估算，如果能结合先进的光谱解混技术和寿命区分，未来或许能实现30种以上探针同时分辨——这听起来就让人期待。

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